PCR e suas variações

A PCR é uma das técnicas utilizadas na identificação e combate do vírus da sars-cov-2, mais comumente conhecido como covid19. Essa técnica teve papel fundamental não só na identificação da doença e combate da mesma mas também ajuda e ajudou muito na descoberta das vacinas que temos hoje no mercado

O descobrimento do método PCR aconteceu em 1983, na Califórnia, quando o bioquímico e surfista Kary Mullis, em uma viagem de férias cogitou, como esse processo aconteceria. Já em 1989, 6 anos depois da descoberta da técnica, a taq polimerase, enzima responsável por analisar ou sintetizar um gene na PCR, é considerada a molécula do ano pela revista Science e, em 1993, acaba por ganhar um Nobel. O nome PCR significa Polymerase Chain Reaction, o que em português seria o equivalente à reação em cadeia da polimerase. É uma relação em cadeia, como o próprio nome diz, e que, tem como principio a utilização dos produtos de um ciclo específico, como molde para o ciclo seguinte.

Fundamentos da PCR

Assim como toda técnica, a PCR tem fundamentos que ajudam a entender a complexidade desse processo e explicar os "como's" e os "por quê's", que rondam e deliberam sobre essas técnicas.

Ocorre através da polimerização in vitro do DNA, onde ocorre a multiplicação do DNA em um tubinho.

Apenas moléculas de DNA conseguem ser colocadas para a realização dessa amplificação de DNA e cDNA, nunca RNA ou proteínas;

Precisando analisar um RNA, primeiro é preciso convertê-lo em cDNA para depois o cDNA entrar na máquina a fim de ampliar a região de interesse;

Isso serve como um controle negativo, visto que se colocarmos um RNA a máquina não amplificará nada, nem aparecerá nenhum resultado, logo significando que aquele RNA não tem nenhum resíduo de DNA, se algo ocorrer, o RNA não estava puro.

➤ Precisa da enzima DNA Polimerase, ela que vai inserir os nucleotídeos livres nessa fita nova que está sendo criada.

Outra questão fundamental na realização da PCR são os iniciadores. Mas o que são eles de fato? São sequências curtas, entre 15-30 nucleotídeos que são desenhadas de acordo com a necessidade do produto de interesse, ou seja, são propriedades altamente específicas e particulares.

O racional da PCR é “eu tenho uma determinada região de um determinado organismo que eu quero estudar e avaliar, então eu vou desenhar Primers para essas regiões”.

Em bioinformática existem plataformas que podemos acessar e colocar qual sequência/organismo queremos trabalhar, lá tem informação de todos os genes já identificados e sequenciados até então. Essas sequências de nucleotídeos já estão anotadas, então podemos ver na hora de desenhar o Primer que queremos.

No entanto, caso não tenha informação nenhuma do gene sendo trabalhado, deverão cloná-lo ao invés de fazer a PCR, pois a clonagem não tem a necessidade de um Primer.

INDICADORES DE PCR

O sentido de ação do Primer depende se ele é considerado forward ou reverso, ou seja, senso ou antísenso. O Primer senso (Forward): vai do 5’ para 3’, se liga na fita 3’-5’, enquanto isso o Primer antisenso (Reverse): vai do 3’ para 5’, se liga na fita 5’-3’.

Já no caso da Taq polimerase, o Primer vai ser desenhado para que a taq consiga ler mesmo no sentido contrário, porque estamos fazendo isso in vitro, logo é possível simular a leitura, sendo possível a leitura de trás para frente (sem precisar de fragmentos).

➤ Os Primers são colocados em excesso na região para que eles se liguem ao DNA alvo de forma ser amplificada. Trabalharemos apenas com o trecho de interesse.

➤Os Primers são colocados em excesso na região para que eles se liguem ao DNA alvo de forma “robusta”, ao invés deles se ligarem entre eles.

A PCR é essa amplificação cíclica, a cada ciclo, novas multiplicações de DNA vão acontecer; novas amplificações, pois estamos amplificando a molécula de DNA, aumentando a quantidade daquela molécula, daquele trecho de DNA que é de seu interesse, à isso se dá o nome de amplificação.

A partir da ponta do Primer, a polimerase entra em ação e vai colocando nucleotídeos para completar essa fita. A primeira etapa é abrir a fita, no que abre a fita, cada fita mãe vai gerar uma fita filha, então ao final desse ciclo teremos dois pares; É formada uma cadeia híbrida, visto que tem uma fita mãe e uma fita filha.

OBS: Mesmo se houver uma cópia com algum erro, ela acabaria sendo perdida ali no meio, pois tem milhares ou até bilhares de cópias dependendo do número de ciclos.

Também podemos ter erros quando os desenhos dos Primers não são tão bons, formando dímeros de Primers, ou seja, ao invés do Primer se ligar ao alvo, eles se ligam entre si, aí ele fará uma amplificação indevida.

Outra opção também são os chamados Hairpins, ou dobramentos, eles não conseguem se ligar à região alvo, então a sua região alvo fica comprometida durante o processo de multiplicação.

Os componentes da PCR:

➝ DNA polimerase (nesse caso é a Taq);

➝ Nucleotídeos dNTP (di nucleotídeos -tri - fosfatado);

➝Nucleotídeos dNTP (di nucleotídeos -tri - fosfatado);

➝ Um tampão 10x;

➝ Tubo de magnésio (quando não vem, o magnésio já está inserido no tampão);

➝ Ambiente adequado (para não levar contaminação) com luz UV;

➝ Amostras bem acondicionadas (como em recipientes com gelo).

Por que o magnésio é importante?

Porque ele é um cofator essencial para a atividade da Taq. Algumas enzimas precisam de cofatores para se tornarem ativas, uma forma de deixar a Taq eficiente para fazer as inserções de nucleotídeos e compor uma nova fita é colocando magnésio, que já vem no kit da DNA polimerase.

Fases da PCR

➝ Desnaturação: Separar as duas fitas. Para conseguir quebrar as pontes de hidrogênio e abrir a fita, a temperatura é 94-95°C.

➝ Anelamento de Primers: Os primers se encaixam de forma correta em suas extremidades correspondentes. A temperatura é 50-56°C.

➝ Extensão: Taq DNA polimerase insere os nucleotídeos. A temperatura é de 72°C.

Obs: isso tudo ocorre muito rápido, cerca de 45 segundos para cada processo do ciclo.

Todo experimento tem a fase de otimização da técnica, onde achamos qual o melhor ponto para aquela reação acontecer, suas condições ideais. Na etapa de otimização se faz um teste de eletroforese para saber quantos ciclos fazer. Alguns termocicladores ajudam nessa etapa prévia de otimização, fazendo uma PCR com o intuito de saber qual é o melhor ciclo e melhor temperatura.

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VARIAÇÕES DA PCR

Como já dito anteriormente, o objetivo da técnica é fazer a amplificação de um alvo que seja muito pequeno, que esteja muito internalizado numa região gênica grande, então usamos duas etapas de pcr, da primeira etapa, usamos um par de primers mais externos. No entanto, não existe apena um tipo dessa técnica, realizada por meio de um termociclador, que faz as 3 etapas dessa técnica, mas que não serve somente para isso.

Variações da técnica:

- Nested PCR;

- RT-PCR: Transcrição reversa seguida de PCR;

- PCR quantitativa em tempo real (qPCR).

A qPCR é a mais recente, mas isso não significa ser a melhor técnica, isso vai de acordo com o objetivo do que será trabalhado.

NESTED PCR

A Nested PCR é geralmente utilizada quando precisamos amplificar um alvo muito pequeno, às vezes com apenas 50 pares de bases, dentro de uma região que é muito extensa.

Fazemos a PCR em duas etapas, usamos 2 pares de primers.

O que está pontilhado é a região alvo, mas antes de chegar na região alvo, faz uma PCR com o DNA da sua amostra, usando primers externos, e ao final teremos os amplicons (produtos da PCR), aí fazemos uma segunda PCR com outros pares de primers, esses internos, ao invés de pôr o DNA como amostra, colocaremos esse produto que foi amplificado anteriormente. Depois, faremos uma outra PCR usando como molde isso que foi amplificado antes, pois o que selecionamos, deixa uma quantidade menor de resíduos que não nos interessa.

Resumindo, usamos a a Nested PCR com a finalidade de amplificar uma região muito pequena que está dentro de uma maior, então para atingir essa região pequena, temos essa possibilidade de fazer uma seleção, onde na 1° PCR usamos o DNA como molde, e na 2° usamos o que foi amplificado com um conjunto de primers para a região interna.

RT-PCR

Como é necessário transformar o RNA em cDNA, pois caso contrário a máquina não amplifica (a menos que o RNA esteja contaminado com alguma parte de DNA), é necessário fazer a transcriptase reversa, onde o RNA vira molde para o cDNA, que será amplificado pela máquina termocicladora que fará a detecção. Ao final do cDNA acontece a amplificação já dentro do ciclo de PCR comum.

Real time PCR (qPCR)

Permite ao cientista visualizar o aumento da quantidade de DNA à medida que ele é amplificado. Se diferencia das demais técnicas porque não precisa ser realizada a etapa da eletroforese para saber se a técnica funcionou mesmo. O resultado se dá de forma gráfica e conta com um aparelho acoplado em um computador. Então, a medida que vai acontecendo a reação, você consegue acompanhar o desenvolvimento da reação pelo computador e, ao final, ele te da uma análise gráfica.

Na qPCR, o resultado é visualizado imediatamente dispensando a eletroforese.

Isto é possível pela adição de sondas fluorescentes às reações de PCR.

O equipamento é capaz de detectar a fluorescência eventualmente produzida pela amostra e assim a técnica permite acompanhar a reação e a apresentação dos resultados em tempo real.

Por meio do monitoramento da taxa de aumento da fluorescência na reação de PCR, é possível determinar com precisão a quantidade de DNA-alvo presente na amostra original.

“Não há psicanálise ou terapia que vá tão fundo na sua cabeça como um PCR. Por outro lado, tenho certeza que ser empalado por um cotonete gigante é um tipo de tortura em algum lugar do mundo. O PCR deixa uma endoscopia sem chinelo, essa ao menos faz curva e tem anestesia.”

Site: https://oglobo.globo.com/cultura/exame-pcr-eu-sobrevivi-24936029

NOTÍCIA ADAPTADA

Por que a RT- PCR é o melhor exame, considerado padrão ouro, para a identificação do SARS-CoV-2?

A RT-PCR pesquisa o material genético do vírus, logo se houver a detecção, significa que o vírus está presente. Diferente de outros testes que por vez pesquisam apenas uma proteína do vírus, fazendo a especificidade e sensibilidade do teste serem menores, visto que existem variantes e mutações na proteína S.

Site: https://www.jornalnh.com.br/noticias/regiao/2021/04/01/entenda-por-que-o-rt-pcr-e-o-melhor-exame-para-covid.html

[...] Espera-se que o segmento de PCR cresça no CAGR maisalto durante o período de previsãodevido aos avanços tecnológicos contínuos nas tecnologiasde PCR, sua capacidade de detectar infecções na fase latente e menos quantidade de requisito de material de modelo parao geral ensaio

Site: http://www.digitaljournal.com/pr/5020482