O método de sequenciamento genômico é uma técnica que permite identificar a sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA ou RNA na ordem correta. Ela visa conhecer a informação genética contida nesta estrutura. Isso é, ao sequenciar um fragmento de DNA, será possível conhecer a sequência em que as quatro bases nucleotídicas (Adenina, Guanina, Citosina e Timina) ocorrem dentro dessa molécula de ácido nucleico.
Os principais objetivos dessa técnica são:
1. Através da identificação da ordem dos nucleotídeos que compõem a molécula de DNA, determinar a estrutura;
2. Detecção de mutações;
3. Tipagem de microrganismos;
4. Determinação de polimorfismos: são as diferenças. Às vezes o polimorfismo irá gerar uma mutação, uma diferença de base, mas não quer dizer que vai ter algum impacto.
MÉTODOS DE SEQUENCIAMENTO
Uma desenvolvida por Allan Maxam e Walter Gilbert (baseada em hidrólise química); guanina na molécula do DNA, foram usados dois métodos:
Uma desenvolvida por Allan Maxam e Walter Gilbert(baseada em hidrólise química);
E outra por Frederick Sanger e cols. (baseada em creações enzimáticas), que permitem determinar a sequência de nucleotídeos de fragmentos de DNA.
No entanto, qual a diferença entre esses dois métodos?
1976-77: Allan Maxam e Walter Gilbert desenvolveram um método de sequenciamento de DNA baseado na modificação química do DNA e na clivagem subsequente de bases específicas:
RESUMO DA TÉCNICA MAXAM E GILBERT:
Marcação da extremidade 5’.
Alíquotas da amostra de DNA divididas em 4 tubos.
Promove modificações na base.
.Reação de clivagem.
Eletroforese em gel.
Autorradiografia.
Interpretação dos resultados.
Modificação Química e Clivagem
Extração do DNA e divisão da amostra em 4 tubos.
Marcação de extremidade 5’ do DNA usando fósforo radioativo: 32P
Em um primeiro tubo: Modificações das bases usando Dimetil Sulfato (DMS)
- Purinas: Adenina e Guanina
Apenas DMS:G
Em um segundo tubo: DMS + Ácido Fórmico (FA):G +A
Clivagem na coluna do fosfato e açúcar
Em um terceiro tubo: Modificação da base usando Hidrazila
- Pirimidinas: Citosina e Timina
Em um quarto tubo: Hidrazila:C + T9.
Hidrazila + NaCL (S): C
FREDERICK SANGER (1918-2013)
"Sanger foi um bioquímico inglês que recebeu em 1958 o seu primeiro Prêmio Nobel de Química, devido à descoberta da estrutura molecular da insulina, de importância fundamental para a síntese desta substância. Simultaneamente, desenvolveu um modelo para a análise estrutural de moléculas de proteína ainda mais complexas, como a hemoglobina. Em 1980, recebeu novamente o Prêmio Nobel em virtude de suas investigações (cujos resultados foram publicados em 1977) sobre a sequenciados nucleotídeos no DNA (ácido desoxirribonucleico) de uma bactéria, que apresenta um total de 5.375 nucleotídeos. Nessa época, ele revelou a elaboração de um mapa da estrutura do DNA humano, constituído por mais de 17 mil nucleotídeos.”
Site: https://educacao.uol.com.br/biografias/frederick-sanger.htm
AXAM E GILBERT X SANGER
A marcação radioativa está em ambas as técnicas. A diferença entre as duas é que a primeira marcava diretamente o DNA sequenciado, enquanto a técnica de Sanger marcava os fragmentos de DNA sintetizados a partir da fita molde.
A síntese de novos fragmentos de DNA a partir da fita molde só foi possível graças ao desenvolvimento da técnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerse).
REAGENTES DA REAÇÃO - SANGER
DNA molde (que deverá ser sequenciado) - em 4 tubos separados;
Enzima DNA polimerase capaz de produzir cópias relativamente fiéis do DNA molde;
Um DNA iniciador (primer) que propicia o inicio da extensão pela DNA polimerase;
Solução tampão, contendo o co-fator magnésio (Mg),necessário para que a enzima DNA polimerase desempenhe sua atividade.
Didesoxinucleotídeos (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP),que atuam como terminadores.
DESOXINUCLEOTÍDEO X DIDESOXINUCLEOTÍDEO
A ausência do grupo OH na posição 3’ impede a entrada de um novo nucleotídeo (por isso este método é também conhecido como “terminador de cadeia” ou “didesoxi”)
ddNTP
Após a adição de ddNTP ocorre a inibição da síntese da cadeia. Usa-se baixas concentrações de ddNTP e altas concentrações de dNTP. Em cada reação, um ddNTP é incorporado aleatoriamente ao invés de dNTP correspondente, provocando a terminação da cadeia.
APRIMORAMENTO DO MÉTODO DE SANGER
ABI 377: Sequenciador que detecta a fluorescência emitida pelos didesoxinucleotídeos e decodifica para determinara sequencia de nucleotídeos do fragmento de interesse;tilizar compostos radioativos prejudiciais à saúde humana. A principal modificação foi a adição aos didesoxinucleotídeos, de corantes capazes de emitir fluorescência quando excitados em comprimento de onda específico. Agora aprimorado, este método utiliza fluoróforos diferentes para cada um dos quatro tipos de didesoxinucleotídeos, que ao serem excitados, emitem luz característica do didesoxinucleotídeo incorporado. Consequentemente, as quatros reações passaram ao correr num tubo único e seu conteúdo podia ser aplicado em uma única canaleta do gel. Assim, o processo se tornou mais rápido e o número de amostras analisadas por corrida era quatro vezes maior.
ABI 377: Sequenciador que detecta a fluorescência emitida pelos didesoxinucleotídeos e decodifica para determinara sequencia de nucleotídeos do fragmento de interesse.
Este método é considerado semi-automatizado, pois o produto das PCRs precisa ser aplicado pelo analista. Este sequenciador possibilitou sequenciar 48 fragmentos de DNA num intervalo de 5 a 6 horas. Os géis difíceis de manusear foram substituídos por finíssimos capilares preenchidos com gel onde os fragmentos de DNA são separados em altíssima velocidade. As amostras são aplicadas através de um sistema de eletroinjeção diretamente nos capilares. Logo após a eletroinjeção, os fragmentos migram e encontram, em um determinado ponto, o feixe de raios laser que excita os fluoróforos presentes na extremidade 3’ de cada fragmento fazendo com que estes emitem fluorescência característica de um dos quatro tipos fluoróforos. Um detector registra esta fluorescência e a transmite para um computador que possui um software capaz de converter fluorescência em picos coloridos, sendo utilizado uma única cor para cada um dos quatro tipos nucleotídeos:
1. verde para Adenina;
2. preto para Guanina;
3. azul para sequenciando genomas 35;
4. vermelho para Timina.
Automatização do método de Sanger
1) Desnaturação da dupla fita, ddNTP marcados com compostos florescentes são incorporados à cadeia nascente de DNA sintetizada pela DNA polimerase.
2) Através de um sistema de eletroinjeção, os fragmentos de DNA recém-sintetizados começam a migrar e encontram, num determinado ponto, um feixe de raios laser que excita os fluoróforos, fazendo com que estes emitam fluorescência característica de um dos quatro tipos de nucleotídeos.
3) Um detector registra a intensidade e comprimento de onda desta fluorescência e a transmite a um computador que possui um software capaz de converter fluorescência em picos coloridos (cromatograma) que são decodificados na sequência de nucleotídeos do fragmento.
ESTRATÉGIAS DE SEQUENCIAMENTO DE DNA
O sequenciamento automatizado, como explicado anteriormente, permite sequenciar com qualidade, aproximadamente 700 nucleotídeos consecutivos de um fragmento.
É necessário:
“Picotar” o DNA em fragmentos menores (todo o DNA do ser vivo analisado (seja uma bactéria, seja um mamífero) é inicialmente particionado em milhões de pequenos pedaços), sequenciar os pedacinhos obtidos e depois sobrepô-los em busca do genoma completo. As técnicas de fragmentação são várias - Exemplos: enzimas de restrição de corte frequente e quebra aleatória por fragmentação mecânica do genoma a ser sequenciado (shotgun).
shotgun = “atirar no escuro”, e é o que acontece. Esse método consiste em bombardear aleatoriamente o genoma a ser sequenciado com partículas que promovem a sua fragmentação. Desta forma, obtêm-se a biblioteca genômica pela inserção de cada fragmento (inserto) num vetor apropriado (clonagem). Fragmentos clonados pequenos (no máximo 1400pb) podem ser completamente sequenciados somente com o uso de primers que anelam no vetor.
Para montar estes milhares de fragmentos sequenciados foi necessário criar programas de bioinformática que tem como objetivo montar a maior sequência possível, utilizando pequenas regiões de sobreposição entre os fragmentos sequenciados, como se fosse um quebra cabeças.
ESTRATÉGIAS DE SEQUENCIAMENTO DO RNA
Quando falamos em genes expressos devemos logo pensar nos RNAs que estão sendo expressos num determinado momento do desenvolvimento celular.
- Temos três RNA processados (em vermelho), contendo os códons de inicio (AUG em verde) e final da tradução (Stop em vermelho), seguido da calda poli-A.
- Os RNAs servem de molde para síntese da fita de cDNA complementares ( mediante uso de transcriptase reversa), sintetizados a partir de um oligonucleotídeo iniciador poli-T, que por consequência, âncora na região poli-A.
- Ocorre a degradação das fitas de RNAs molde e síntese de uma nova fita de DNA complementar à fita recém sintetizada.
