Extração de ácidos núcleicos e Eletroforese

Paloma Carvalho
30 de mar. de 2021
3 min de leitura

Atualizado: 7 de abr. de 2021

O DNA fica muito protegido no interior da célula, por isso é necessário a exposição dele, e fazermos todos os processos para chegarmos às informações desejadas.

Então, para fazer a extração tanto dele, quanto do RNA, precisamos seguir algumas etapas, são elas:

Segue a explicação de cada uma dessas etapas:

LISE CELULAR: “Lise” = quebra. Expõe o DNA. Quebra as membranas para que tenhamos acesso ao material. Um detalhe importante é saber se o pH do material usado com essa finalidade está adequado.

PURIFICAÇÃO DO DNA: Nesse processo há a remoção dos lipídios da membrana celular por serem contaminantes e atrapalharem na análise de pureza da amostra, e para isso é necessário o uso de alguns detergentes especiais. E também há a desproteinização para remover proteínas indesejadas, isso quando o alvo não é a proteína, e sim o DNA. Porém, pode ocorrer o contrário também, assim como como RNA. Então, soluções que são protocolos ajudam de acordo com o que queremos.

EX: Trizol

Informações retiradas do site: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15596026#/15596026

PRECIPITAÇÃO: Ocorre a concentração do que está sendo alvo de análise, do ácido nucleico, ele se separa do restante dos componentes celulares, usando para isso o etanol ou isopropanol.

REIDRATAÇÃO: É preciso dessa etapa para que o ácido nucleico volte a ficar disperso nomeio, pois na etapa anterior havia ficado apenas o pellet. Para isso utiliza DNAse, TE, RNAse... dependendo do que está sendo trabalhado.

O DNA precisa ficar estocado a -20°C, e o RNA a -70°C.

QUANTIFICACAO DO MATERIAL EXTRAÍDO

Após esse processo, é preciso dessa etapa para que o ácido nucleico volte a ficar disperso no meio, pois na etapa anterior havia ficado apenas o pellet. Para isso utiliza DNAse, TE, RNA-se... dependendo do que está sendo trabalhado.

A espectrofotometria (mais utilizada) é baseada na adição de um feixe de luz à amostra, sendo quantificada a quantidade que for absorvida, havendo um cálculo do que entrou e do que saiu.

Atualmente, vários computadores fazem essa conversão e já dão o espectro.

Exemplos de alguns espectrofotômetros:

NANODROP

QUILBIT

MÉTRICA DE PUREZA

Sobre o DNA:

Possui absorvância em um comprimento de onda na faixa de 260nm.

A Razão 260 / 280 nm mostra a pureza do material:

≥ 1,75 – 1,80 = material do boa qualidade(puro).

< 1,75 = Contaminação por lipídios e / ou proteínas.

Sobre o RNA:

Na quantificação, a Razão 260 / 280 nm ideal é = 2.

RNA em relação a proteína:

- A260/280 = 1,9a 2,1;

RNA em relação a outros contaminantes:

- A260/230 = 1,5 e 1,8;

DNA em relação a proteína:

- A260/280 =1,75 a 1,8;

RNA em relação a outros contaminantes (fenóis, EDTA, carboidratos, etc):

- A260/230 = <1,75;

SE ESTIVER FORA DESSES PADRÕES, A AMOSTRA PODE ESTÁ COMPROMETIDA!!!

Artigo: https://www.centerlab.com/blog/In-formativo_107/https://www.centerlab.com/blog/Informativo_107/

Logo abaixo, a primeira estrofe que vemos trata sobre a importância de trabalhar com DNA de boa qualidade em reações de PCR, tópico que será abordado mais adiante.

DIFERENTES TIPOS DE EXTRAÇÃO

DNA

- Fenol Clorofórmio;

- Trizol;

- Kits Comerciais;

RNA

- Mesmo que DNA, só acrescenta DNAzol.

Lembrando que:

É sempre preciso a pergunta para saber o que queremos MESMO. Com a pergunta referente à proposta de trabalho, que vamos saber qual o melhor kit, equipamentos a serem utilizados!

Notícia relacionada a uma pesquisa feita a partir de extração de DNA:

Link: https://www.bbc.com/portuguese/vert-fut-55936968

ELETROFORESE

A ELETROFORESE EM GEL

É o método mais utilizado na separação DNA, RNA e proteínas.

- As macromoléculas atravessam os poros de gel ao migrarem no campo elétrico.

- A composição do gel vai de acordo com o trabalho a ser feito, com a qualidade do material a ser separado, então pode ser agarose ou poliacrilamida.

GEL DE AGAROSE

É um gel importante para a separação de DNA e RNA.

Deve ser pesada e dissolvida com tampão de TBE ou TAE

Link: https://www.ijxdroid.com/2021/03/31/mercado-sistema-de-eletroforese-em-gel-de-agarose-analise-da-industria-gobal-por-tendencias-tamanho-crescimento-e-previsao-ate-2027/