CRISPR é a sigla para: Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Espaçadas (ClusteredRegularly Interspaced Short Palindoromic Repeats) e corresponde a uma parcela do DNA que foi observado em células procariotas (bactérias) como imunidade adaptativa contra “invasão” de DNA viral.
Jennifer Doudna(UCLA) e Emmanuelle Charpentier (Instituto Max Planck) publicaram em 2012 um artigo descrevendo o uso do sistema CRISPR/Cas9 no corte (edição) de plasmídeo de DNA de fita dupla em bactérias. No entanto, anos atrás por volta dos anos 2000, descobriu-se que existia um sistema imune adaptativo nessas bactérias que faziam então uma espécie de tesoura molecular que eliminava o DNA exógeno, mas não apenas eliminava como uma enzima de restrição, mas faziam um reparo sendo um sistema imunológico que fazia parte da bactéria naturalmente.
A descoberta delas foi que esse sistema poderia ser manipulado. Pegando-se essa estrutura da bactéria e usar essa estrutura para fazer a edição genética sobre o gene de interesse.
SISTEMA DE DEFESA BACTERIANO
Chamado de CRISPR/Cas, o sistema é acionado quando o vírus entra na bactéria: Esta reconhece o DNA exógeno e enzimas (Cas) cortam pedaços deste material e os introduzem em uma região genômica específica da bactéria, chamada de lócus CRISPR.
Nas próximas infecções virais, as bactérias que contêm esses pedaços do DNA do vírus inseridos no lócus CRISPR geram um RNA a partir dessa sequência. Quando houver a transcrição dessa porção onde foi colocado DNA exógeno, este RNA irá se associar à enzima Cas e, então, dirigir-se ao DNA viral, que é então clivado e, assim, inativado.
OBS: Cas ou Cas9, mais especificamente, está relacionada a essa estrutura que serve de tesoura molecular fazendo os cortes específicos.
Mas.... O que de fato é essa técnica?
CRISPR é um arranjo de pequenas sequências repetidas com espaçadores de sequências diferentes, podendo ser observado tanto em DNA cromossômico, quanto em plasmídeos.
COMPLEXO CRISPR/CAS9
Um curto RNA sintético contendo uma sequência necessária para ligar a nuclease Cas9 e uma sequência definida pelo usuário específica para o alvo, orienta o complexo RNA/nuclease para o gene de interesse.
Pode-se fazer o RNA guia em laboratório. Baseado na sequência alvo se fará um RNA guia que vai se ligar a nuclease, ao sistema de CAS9 e então o RNA mais a nuclease do CAS9, a enzima de corte (tesoura molecular), esse complexo vai se ligar na porção desejada e assim poderá, além de cortar a região, se ligar a porção que se deseja desativar.
A sequência alvo deve ser única, específica, dentro do genoma e localizada perto de um motivo adjacente (uma região de nucleotídeos conhecidas) de proto espaçador (PAM): um sinal de ligação para as proteínas Cas.
A sequência deve ser única para evitar a inativação de uma célula errada.
A ligação de RNA guia (sgRNA) ao Cas9 aciona a atividade da nuclease permitindo que Clivagem do DNA de interesse daquela região ocorra.
PRINCIPIOS DA TÉCNICA
O princípio do sistema CRISPR/CAS9 é simples: uma molécula de RNA não codificante guia a nuclease Cas9 para uma sequência de gene induzindo uma clivagem específica do local.
O dano ao DNA é reparado por vias de reparo do DNA celular:
Reparo de junção de extremidade não homóloga (NHEJ): é uma via eficiente mas sujeita a erros, introduzindo inserções e deleções (dos nucleotídeos) que podem afetar o gene.
Reparo dirigido por homologia (HDR): é menos eficiente, mas com alta fidelidade, permitindo mudanças específicas nos nucleotídeos gerados (de um único nucleotídeo mudado à grandes inserções possíveis de visualizar por esse sistema).
O complexo apresentado na imagem é formado pela CAS9 junto com o RNA guia.
O RNA guia vai se unir. O complexo vai se unir a não-homóloga e guiar dois modos: através dos proto espaçadores com os motivos que chamam a atenção para onde esse complexo deve se unir.
O complexo pode seguir duas vias de reparo: a não-homóloga(podendo clivar o DNA invasor e o eliminar, e unindo a fita de novo) ou a via mais direta que é por trechos de nucleotídeos no meio ou deletá-los, esta via é a mais utilizada.
OS TRES ESTÁGIOS DO FLUXO DE TRABALHO EXPERIMENTAL
1°) DESENHO: Escolha do melhor e/ou componente mais específico para uma célula em particular – Ex: RNA guia ou a Nuclease CAS;
2°) ENTREGA: Escolha o melhor formato (DNA de plasmídeo, RNA, ribonucleoproteína) e método de entrega (eletroporação, lipofecção, vírus) para permitir que o processo de edição ocorra dentro de uma célula;
3°) ANÁLISE: caracterizar as edições usando PCR e Sanger ou métodos de sequenciamento de última geração para determinar a eficiência da edição de genes e selecionar mutações de interesse.
Mas ai surge a pergunta, qual a diferença entre o RNA guia e a Cas9?
Elementar meu caro Sherlock Holmes, a CAS9 funciona como uma tesoura molecular, ela é quase uma enzima de restrição, funciona como corte mas precisa do RNA guia para cortar. Já o RNA guia vai se unir ao sistema e guiar até a região do DNA de interesse pra ser editado para então realizar o corte e a inativação.
EXEMPLOS DE APLICAÇÃO:
Esse sistema de defesa pode ser modificado para se tornar uma ferramenta de edição do genoma. (editando com que propósito? Questão de bioética muito presente).
Em vez de cortar o DNA viral invasor, a Cas9 é “carregada” com um RNA guia que irá indicar que parte do DNA de um ser vivo deve ser cortada.
Depois que ocorre esse dano na fita dupla de DNA, a célula começa um processo de reparo, que geralmente leva a retirada ou adição de nucleotídeos, descaracterizando a informação contida na antiga sequência, inutilizando o gene.
Esse primeiro processo pode ser visado para “destruir” genes causadores de doenças, como a hemofilia, que é hereditária.
Ou pode ajudar a identificar a função de determinado gene, analisando a diferença entre organismos com o gene ativo, e outros com o gene silenciado pelo processo.
Em um segundo tipo de restauração, um novo pedaço de DNA, que traz novas informações, pode ser incorporado para ligar as duas pontas que foram desconectadas, possibilitando inserir características de interesse nos organismos, como tornar espécies agrícolas mais resistentes a condições climáticas ou mais produtivas.
Por ser muito diversos, esses experimentos devem ser acompanhados e analisados atentamente pela bioética para evitar que os cientistas se percam e comecem a “brincar de deus”, assim mantendo uma coerência nas pesquisas.