O nascimento do termo “clone” foi ação de Herbert Webber em 1903 – início do século XX. No entanto, o que são clones? Eles podem ser definidos como um conjunto de células, ou moléculas, que descendem de uma mesma matriz, como por exemplo, brotamento de plantas que são geneticamente idênticos e estão relacionados a reprodução assexuada.
A ovelha Dolly, foi primeiro experimento de clonagem que obteve resultado positivo. Realizado em 1997, consistia em um protótipo de ovelha que apresentava características da ovelha graças ao núcleo utilizado que continha as informações de DNA dela. No entanto, por mais que tenha sido um experimento de sucesso, Dolly morreu muito jovem. A informação genética utilizada, ou seja, as células foram de uma ovelha mais velha, o que gerou uma incompatibilidade genética. As células usadas faziam com que a idade genética de Dolly não ser compatível com sua carcaça jovem.
CONCEITO
A clonagem molecular é o processo de construção do DNA recombinante, o DNA que se quer trabalhar. O DNA de interesse ou parte dele e sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitem a seleção do gene de interesse. Trabalha-se no processo de construção do DNA recombinante além de um hospedeiro, ou seja, uma célula capaz de receber e selecionar esse gene de interesse.
ETAPAS DA CLONAGEM
Preparação do DNA vetor (escolha do vetor);
Preparação do inserto (PCR prévia);
Ligação: DNA vetor e inserto;
Transformação: Introdução de DNA recombinante nas células hospedeiras (Células competentes);
Multiplicação das células e dos clones recombinantes;
Seleção e identificação de clones recombinantes.
Mas, por que clonar? É importante para processos como:
Sequenciamento de DNA;
Separar fragmentos de DNA em clones independentes;
Estudar a transcrição e tradução do gene;
Fazer estudos de expressão funcional;
Sintetizar proteína para produção de anticorpos - é realizado em Farmanguinhos.
Sintetizar proteína para uso terapêutico - também feito em Farmanguinhos
É crucial na produção de insulina através de DNA recombinante.
MAS PORQUE AINDA USAMOS A CLONAGEM HOJE?
Um experimento de PCR pode ser completado em poucas horas, ao passo que a obtenção de um gene por clonagem pode levar semanas ou meses. Por que a clonagem gênica ainda é usada?
A PCR só pode ser utilizada para usar genes previamente estudados, já a clonagem gênica pode estudar genes nunca estudados anteriormente.
A PCR necessita da sintetização do primer para ser realizada – fazer o desenho dos iniciadores para saber a sequência. Enquanto, dependendo do tamanho, a clonagem pode chegar a fazer o DNA inteiro.
Há um limite para extensão de sequências de DNA pela PCR (até 5Kb–5 mil pares de base). A clonagem faz essas extensões em uma escala muito maior de tamanho, pode chegar a fazer o DNA inteiro.
No entanto, para realizar a clonagem é necessária a presença de células competentes que sejam ideais para esse processo
Capacidade da célula de permitir a entrada de DNA através de sua membrana;
Células bacterianas ou de leveduras que irão utilizar a maquinaria da célula para multiplicar o DNA recombinante – material de interesse;
Essas células se apropriam do DNA recombinante e no momento em que entram naturalmente em seus ciclos de vida de se multiplicar – fazer suas divisões binárias -, ao se dividirem elas levam o material de interesse que está sendo estudado.
Não é possível utilizar células humanas por embargos bioéticos, morais, etc.
No experimento da ovelha Dolly não foram usadas células competentes, pois se utilizou o método da “barriga de aluguel” – onde depositavam o óvulo fecundado em uma ovelha que realizaria o ciclo de gestação.
A célula competente está apenas recebendo o material genético e vai promover a multiplicação do fragmento através das vias metabólicas das próprias células vivas.
A célula competente não tem o intuito de clonar mamíferos, e sim focar na produção em quantidades – grandes quantidades de genes de DNA recombinante.
CARACTERÍSTICAS DAS CÉLULAS COMPETENTES
Ser quimicamente competente ou eletrocompetente;
Crescimento rápido;
Não-patogênica;
Capaz de receber e multiplicar o inserto (DNA recombinante);
Exemplos: E.coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae.
VETORES DA CLONAGEM
Moléculas de DNA dupla fita;
Capacidade de replicação;
Sítios únicos de restrição para clonagem - Enzimas de restrição, pontos de corte específicos desse tipo de DNA;
Possuir um ou mais genes para seleção;
Devem ser capazes de replicar e serem isolados independentemente do genoma do hospedeiro;
Marcador selecionável - um gene que permita que as células hospedeiras contendo o vetor sejam selecionadas. Ex: Sítios de resistência a antibióticos.
CLONAGEM BACTERIANA
Plasmídeos: fragmentos até 10Kb (mais comum nos laboratórios);
Bacteriófagos: fragmentos até 20Kb;
Cosmídeos: fragmentos até 40Kb;
BACs (cromossomo artificial bacteriano): até 300Kb.
PLASMIDEOS
DNA circulares bacterianos(independentes do cromossomo maior) -> recebem de 100 a 10.000 pb -> duplicação independente do cromossomo -> presentes em múltiplas cópias -> genes importantes.
Plasmídeos tem características importantes como sítios de resistências a antibióticos, locais específicos de ancoragem de enzimas de restrição (tesouras que cortam os agentes exógenos, vírus, etc). Eles têm uma série de aparatos para proteger a célula bacteriana.
O Plasmídeo está presente na célula bacteriana e faz parte de sua natureza. Ele também é independente e por isso serve como vetor para carregar o material de estudo.
O plasmídeo já é comprado com todas as enzimas que precisa fazer o plasmídeo atuante pra clonagem.
BACTERIÓFAGOS
Vírus que infectam especificamente as bactérias;
Recebe maior quantidade de DNA (10.000 a 20.000 pb), versatilidade.
COSMÍDEOS
São híbridos entre plasmídeos e bacteriófagos;
São utilizados como veículos de clonagem molecular através do empacotamento in vitro (aumentando assim a capacidade de recebimento de DNA) -> reconstitui a estrutura do fago em cabeça e cauda: usados para infectar a célula hospedeira;
As enzimas de empacotamento reconhecem dois locais cos com distância de 35.000 a 49.000 pb, o que limita o tamanho dos fragmentos passíveis de serem empacotados (região onde haverá a inserção do material trabalhado);
Amp – resistência a penicilina;
Região cos – se tem uma serie de enzimas de restrição que se pode trabalhar para fazer a inserção do plasmídeo nessa região.
ETAPAS
Ligação; Promoção da inserção do meu DNA de interesse. Consiste na união do DNA recombinante, ou produto amplificado, com o plasmídeo. As empresas vendem o plasmídeo já aberto e só é necessário inserir o DNA com uma enzima de ligação que assim o fecha.
Objetivo: fazer com que o plasmídeo entre na célula competente e se ligue ao plasmídeo natural para que a medida que a célula se multiplicar se multiplique carregando o material de interesse.
Transformação; se pega o vetor que já recebeu o material de interesse e o coloca em contato com a célula competente para que a célula cresça e etc.
Seleção dos clones.
PREPARAÇÃO DO DNA VETOR E INSERTO
VETOR
Digestão com enzimas de restrição; se o vetor estiver circularizado.
INSERTO
O que se deseja clonar (DNA genômico, cDNA, um gene específico, PCR, etc)
PREPARAÇÃO DO INSERTO
Pode se fazer PCR ou pegar o DNA total, tratar com a enzima de restrição que vai cortar em fragmentos e então pode-se fazer um gel de eletroforese e se selecionar o tamanho desejado do DNA fragmentado, purifica-se e clona apenas a porção selecionada, etc. Tudo depende do que se quer clonar.
A separação – extração – do DNA. Em casos de genomas menores é possível fazer com o genoma total. Seleção do Gene de interesse (EX: PCR).
TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
É quando se coloca o plasmídeo – com a parte do gene de interesse ligado a ele - no interior da célula hospedeira (célula competente);
Duas possibilidades: com tratamento químico (choque químico) ou eletroporação.
No tratamento líquido depois do choque térmico, se coloca o tubo numa caixa com gelo e se leva a cabine de segurança. Depois coloca-se meio de crescimento bacteriano e deixa incubando por um tempo.
Em ambos os tratamentos – tanto com choque, quanto com o cloreto de cálcio, vai haver a abertura dos poros da célula competente. Com essa abertura, o DNA recombinante vai se inserir junto da estrutura do plasmídeo da própria bactéria e ali ele vai crescer.
SELEÇÃO DAS COLÔNIAS
Depois de um certo tempo de crescimento, vai se colocarem uma placa de Petrifeita com meio agár e meio LB. Depois adiciona o X-Gale o IPTG, que são indutores e então semeia-se a bactéria que ficou crescendo no meio líquido que contém o DNA recombinante.
Gene LacZ -> responsável por produzir a enzima B-galactosidase.
A enzima age sobre o substrato incolor X-Gal, convertendo-o em um corante azul.
Depois dessa etapa, a colônia branca condiz aquela que a clonagem foi bem sucedida, pois não houve a degradação do X-Gal.
Cada colônia vai ser posto em um tubo falcon (15ml) com antibiótico. Esses tubos são encubados por 18h para que haja uma turbidez do material líquido que vai ser centrifugado e depois vai haver a extração do DNA plasmidial.
MAPA DO VETOR
O antibiótico usado será determinado pelo sítio de resistência do plasmídeo adotado.
MIX DA REAÇÃO
Para avolumar uma reação, utiliza-se água.
TRANSFORMAÇÃO
PLAQUEAMENTO
37°C – Overnight
FATOS EXTRAS
Quando falamos em clonagem, normalmente nos lembramos das técnicas realizadas em laboratório em que é possível produzir um indivíduo idêntico a outro. Entretanto, a formação de clones é possível também na natureza por meio do processo de reprodução assexuada. Um exemplo são as bactérias, em que pode ocorrer a reprodução por divisão binária, em que um indivíduo divide-se em dois. Nesse caso, o indivíduo formado é idêntico à célula-mãe e, portanto, um clone.
As enzimas de restrição são sintetizadas apenas pelas bactérias.
A Engenharia Genética consiste numa técnica de manipular genes, que permite, entre outras coisas, a fabricação de produtos farmacêuticos em bactérias transformadas pela tecnologia do DNA recombinante. Assim, já é possível introduzir em bactérias o gene humano que codifica insulina, as quais passam a fabricar sistematicamente essa substância. Isto só é possível porque as bactérias possuem pequenas moléculas de DNA circulares (plasmídeos), nas quais podem ser incorporados genes estranhos a elas, experimentalmente.